Ngoài ra, kỹ thuật FISH còn được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán trước sinh, để phát hiện những bất thường số lượng của một số nhiễm sắc thể thường gặp (13,18,21,X,Y).
Quy trình tiến hành kỹ thuật FISH
Soi tiêu bản dưới kính hiển vi phát hiện bất thường nhiễm sắc thể. Nguồn ảnh: fablabroma.it
Kỹ thuật FISH được tiến hành dựa trên cơ sở của phản ứng lai ghép. Trong tế bào, phân tử ADN tồn tại dưới dạng phân tử kép gồm 2 chuỗi đơn gắn kết bổ sung với nhau thông qua liên kết hydro. Liên kết hydro là liên kết yếu nên dễ dàng bị đứt gãy dưới tác động của nhiệt độ hay pH cao. Lúc đó, phân tử ADN bị tách thành 2 chuỗi đơn. Tuy nhiên khi nhiệt độ hay pH giảm, các chuỗi đơn lại ghép nhau theo nguyên tắc bổ sung.
FISH là kỹ thuật lai hóa các đoạn dò (chuỗi DNA) có gắn chất phát huỳnh quang với DNA đích của BN trên các NST dưới dạng tế bào phân chia (metaphase) hay không phân chia (interphase). Đoạn DNA đích sau khi được cố định trên bề mặt tiêu bản, biến tính và lai hóa ở điều kiện thích hợp với đoạn DNA có gắn chất phát huỳnh quang tạo thành chuỗi ADN xoắn kép. Sau quá trình lai, tiêu bản được rửa nhằm loại bỏ các đoạn DNA bắt cặp không đặc hiệu và được cố định màu bằng dung dịch DAPI II counterstain. Kết quả được phân tích dưới kính hiển vi huỳnh quang nhằm phát hiện những bất thường về NST và các gen liên quan.
Các bước tiến hành
Bước 1: Lấy bệnh phẩm
- 2ml máu ngoại vi hoặc dịch hút tủy xương được đựng trong bơm tiêm có tráng chất chống đông heparin 5.000 đơn vị/ml. Máu hoặc tủy xương được nuôi cấy trong 24 giờ.
- Sau 24 giờ, tiến hành thu hoạch huyền dịch tế bào.
Bước 2: Chuẩn bị tiêu bản
- Nếu sử dụng kỹ thuật FISH trên các cụm kỳ giữa (metaphase) thì cần nuôi cấy và chuẩn bị tiêu bản như kỹ thuật xét nghiệm công thức nhiễm sắc thể.
- Trong trường hợp sử dụng trên nhân tế bào thì có thể bỏ qua bước nuôi cấy.
- Nhỏ huyền dịch tế bào lên tiêu bản.
- Yêu cầu: Hình thái nhân rõ ràng, tế bào dàn đều, các cụm nhiễm sắc thể kỳ giữa to và sắc nét.
- Dùng bút kim cương đánh dấu trên bề mặt tiêu bản những vùng đáp ứng được yêu cầu trên.
Bước 3: Rửa tiêu bản
- Ngâm tiêu bản vào dung dịch 2X SSC ở 37 ± 1°C trong 15 phút.
- Rửa tiêu bản qua cóng chứa dung dịch 2X SSC ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
- Chuyển tiêu bản qua cóng chứa dung dịch formaldehyde 10% ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
- Rửa tiêu bản qua cóng chứa dung dịch 2X SSC ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
- Chuyển tiêu bản qua cóng chứa cồn 70° trong 1 phút.
- Chuyển tiêu bản qua cóng chứa cồn 85° trong 1 phút.
- Chuyển tiêu bản qua cóng chứa cồn 100° trong 1 phút.
- Để tiêu bản khô hoàn toàn ở nhiệt độ phòng.
Bước 4: Chuẩn bị một đoạn mồi đặc hiệu (probe)
- Trộn đều các dung dịch sau trong 1 ống PCR (1 μl probe + 7 μl LSI + 2 μl dH2O)/1 tiêu bản.
- Ly tâm nhẹ.
- Lai.
- Nhỏ 10 μl dung dịch probe vào khu vực đánh dấu trên tiêu bản sau đó che phủ bằng coverslip.
- Yêu cầu: Dung dịch probe thấm đều trên tiêu bản, không có bọt khí.
- Phủ kín coverslip bằng cao su xi măng.
- Đặt tiêu bản vào máy lai, chọn chương trình biến tính ở 73°C trong 3 phút và ủ 37°C trong 16 - 20 giờ.
- Rửa sau khi lai.
- Gỡ bỏ xi măng cao su và coverslip.
- Ngâm và lắc mạnh tiêu bản lần lượt qua các cóng Coplin sau: Dung dịch (0,4X SSC/ 0.3% NP40) trong 2 phút, 73°C và dung dịch (2X SSC/0,1% NP40) trong 1 phút, nhiệt độ phòng.
- Làm khô tiêu bản.
- Chống mất màu probe: Nhỏ 10 - 20 μl dung dịch DAPI/antifade (1:20) lên bề mặt tiêu bản để chống mất màu probe và nhuộm nhân tế bào.
- Phủ kín tiêu bản bằng coverslip.
- Yêu cầu: Dung dịch dàn đều trên tiêu bản và không có bọt khí.
Ứng dụng kỹ thuật FISH trong y học
Kỹ thuật FISH được sử dụng để sàng lọc và phát hiện sớm dị tật bẩm sinh của thai nhi Nguồn ảnh: kknews.cc
Thông thường những gia đình có con mắc những khuyết tật bẩm sinh muốn biết nhiều hơn về tình trạng của trẻ trước khi đưa ra quyết định sinh thêm con. Nỗi lo lắng này có thể được giải quyết bằng phân tích ADN của bố mẹ và đứa con. Trong trường hợp khuyết tật của đứa con chưa được hiểu rõ ràng, nguyên nhân gây khuyết tật có thể được xác định được khi sử dụng kỹ thuật lai FISH và các kỹ thuật nghiên cứu di truyền tế bào.
Trong y học, FISH có thể được sử dụng để chẩn đoán, đánh giá tiên lượng hoặc đánh giá khả năng tái phát của một bệnh, ví dụ như ung thư. FISH cũng có thể được sử dụng để tìm kiếm các tế bào bị bệnh dễ hơn so với các phương pháp di truyền tế bào khác, vì các phương pháp đó thường đòi hỏi các tế bào đang ở pha phân chia, đòi hỏi thời gian, các bước chuẩn bị thủ công tốn thời gian, sức lực và kinh nghiệm của kỹ thuật viên khi phân tích tiêu bản. Ngược lại, phương pháp lai FISH không cần đòi hỏi tế bào sống và có thể đánh giá định lượng một cách tự động, máy tính có thể đếm các điểm huỳnh quang.
Kỹ thuật FISH được chỉ định trong các trường hợp sau:
- Chẩn đoán trước sinh các bất thường số lượng NST ở thai nhi.
- Phát hiện các mất đoạn nhỏ ở một số hội chứng di truyền.
- Xác định các đoạn nhiễm sắc thể chưa rõ nguồn gốc.
- Phát hiện các bất thường nhiễm sắc thể đặc hiệu trong ung thư.
Kỹ thuật FISH trong chẩn đoán trước sinh
Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ FISH được sử dụng để sàng lọc một số hội chứng di truyền thường gặp: Hội chứng Down (ba nhiễm sắc thể 21), hội chứng Patau (ba nhiễm sắc thể 13), hội chứng Eswos (ba nhiễm sắc thể 18), hội chứng Turner (một nhiễm sắc thể X), hội chứng Kleinerfelter (XXY)… với ưu điểm:
- Nhanh: Thời gian xét nghiệm trong vòng 48h kể từ khi nhận mẫu dịch ối. Hoàn thành các thủ tục quản lý chất lượng xét nghiệm sau 4 ngày. Chú ý, các quyết định đình chỉ thai nghén không nên chỉ dựa vào kết quả FISH.
- Độ chính xác cao.
- Yêu cầu chỉ 10-20ml dịch ối.
- Có thể thực hiện trên mẫu bệnh phẩm gai rau.
Kỹ thuật FISH phát hiện mất đoạn nhỏ nhiễm sắc thể ở một số hội chứng di truyền:
- Tỷ lệ gặp từ 1/5000 - 1/8000 trẻ sống do mất một đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể tương ứng, không phát hiện được trên công thức nhiễm sắc thể thông thường. FISH giúp khẳng định các chẩn đoán lâm sàng và chẩn đoán trước sinh cho các gia đình có tiền sử sinh con mắc các hội chứng này.
Kỹ thuật FISH giúp phát hiện các bất thường nhiễm sắc thể đặc hiệu trong ung thư:
- Bạch cầu cấp thể tủy hoặc thể lympho: Đánh giá các thay đổi về nhiễm sắc thể, đặc biệt sự có mặt của một số chuyển đọan đặc hiệu như chuyển đoạn nhiễm sắc thể số 9 và 22 (Ph1), số 4 và 11, số 8 và 21... có giá trị phân loại và tiên lượng điều trị.
- U nguyên bào thần kinh: Đánh giá các thay đổi về nhiễm sắc thể, đặc biệt là sự lặp đoạn của gen NMYC, mất đoạn nhánh ngắn nhiễm sắc thế số 1, và thêm đoạn nhánh dài nhiễm sắc thể số 7... có giá trị phân loại và tiên lượng điều trị.
