Real-Time PCR là gì?
Trong xét nghiệm PCR thông thường, sản phẩm khuếch đại DNA, hoặc amplicon – đơn vị siêu sao chép, được phân tích khi PCR hoàn tất (end-point). Trong real- time PCR, sự tích lũy của sản phẩm khuếch đại được đo khi phản ứng đang diễn ra trong thời gian thực, định lượng sản phẩm sau mỗi chu kỳ.
Quy trình qPCR dưới đây mô tả các bước trong real- time PCR. Đầu tiên, thiết lập các phản ứng khuếch đại với thuốc thử PCR và mồi đặc hiệu hoặc tùy chỉnh. Các phản ứng sau đó được tiến hành trong các thiết bị real – time PCR và phân tích dữ liệu thu thập được bằng phần mềm.
Nguồn ảnh: https://www.bio-rad.com.Tính năng phát hiện các sản phẩm PCR theo thời gian thực được thực hiện bằng cách đưa phân tử phóng xạ huỳnh quang vào mỗi giếng phản ứng để tạo ra tín hiệu huỳnh quang tăng tương ứng với sự tăng lượng sản phẩm DNA. Các hóa chất huỳnh quang được sử dụng bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA và mồi hoặc đầu dò trình tự cụ thể được đánh dấu huỳnh quang. Các bộ chu kỳ nhiệt chuyên dụng được trang bị mô-đun phát hiện huỳnh quang được sử dụng để theo dõi tín hiệu huỳnh quang khi quá trình khuếch đại xảy ra. Độ huỳnh quang đo được tỷ lệ với tổng lượng amplicon, sự thay đổi của huỳnh quang theo thời gian được sử dụng để tính toán lượng amplicon được tạo ra trong mỗi chu kỳ.
Ưu điểm chính của real – time PCR so với PCR là real – time PCR cho phép xác định số lượng bản sao ban đầu của DNA mẫu (chuỗi khuếch đại đích) với độ chính xác và độ nhạy cao trên một khoảng giá trị dao động rộng. Kết quả real time PCR có thể là định tính (có hoặc không có trình tự gen) hoặc định lượng (số bản sao). Do đó, real – time PCR định lượng còn được gọi là phân tích qPCR. Ngược lại, PCR bán định lượng là tốt nhất. Ngoài ra, dữ liệu real – time qPCR có thể được đánh giá mà không cần điện di trên gel, do đó giảm thời gian làm việc và tăng thông lượng. Cuối cùng, các phản ứng real – time qPCR được chạy và dữ liệu được đánh giá trong một hệ thống qPCR kín, thống nhất, các số liệu nhiễu được giảm bớt và loại bỏ nhu cầu vận hành sau khuếch đại trong phân tích qPCR.
Các ứng dụng của xét nghiệm real – time PCR / qPCR
Xét nghiệm real –time PCR / qPCR là phương pháp xác định nhanh và nhạy để định lượng axit nucleic trong các mẫu sinh học khác nhau, với các ứng dụng đa dạng như phân tích biểu hiện gen, phát hiện sinh vật biến đổi gen trong thực phẩm và định hình kiểu hình ung thư.
Trong các phòng nghiên cứu, xét nghiệm qPCR được sử dụng rộng rãi để đo định lượng số lượng bản sao gen (liều lượng gen) trong các dòng tế bào được biến nạp hoặc sự hiện diện của gen đột biến. Kết hợp với PCR phiên mã ngược (RT-PCR), xét nghiệm qPCR có thể được sử dụng để định lượng chính xác những thay đổi trong biểu hiện gen, ví dụ, sự tăng hoặc giảm biểu hiện đáp ứng với các điều kiện môi trường khác nhau hoặc điều trị bằng thuốc, bằng cách đo lường những thay đổi trong tế bào ở mức mRNA.
Real – time PCR hoạt động như thế nào?
Để hiểu cách real – time PCR hoạt động, bài viết này sử dụng biểu đồ khuếch đại điển hình để minh họa phân tích qPCR. Trong biểu đồ này, số chu kỳ PCR được hiển thị trên trục x và huỳnh quang từ phản ứng khuếch đại, tỷ lệ với lượng sản phẩm khuếch đại trong ống, được hiển thị trên trục y.
Biểu đồ khuếch đại cho thấy hai giai đoạn: lũy thừa và bình nguyên. Trong giai đoạn lũy thừa, lượng sản phẩm PCR tăng gấp đôi trong mỗi chu kỳ. Tuy nhiên, khi phản ứng tiếp tục, các thành phần phản ứng bị tiêu hao và cuối cùng cạn kiệt. Tại thời điểm này, phản ứng chậm lại và đi vào giai đoạn bình nguyên (chu kỳ 28–40, Hình 1).Ban đầu, tín hiệu huỳnh quang vẫn ở mức nền và không thể phát hiện được sự gia tăng huỳnh quang (chu kỳ 1–18, Hình 1) ngay cả khi sản phẩm tích lũy theo cấp số nhân. Khi sản phẩm khuếch đại tích lũy đủ, máy sẽ bắt đầu ghi lại tín hiệu huỳnh quang phát ra. Số chu kỳ khi xảy ra hiện tượng này được gọi là chu kỳ định lượng hoặc Cq. Vì giá trị Cq được đo trong giai đoạn lũy thừa khi thuốc thử không bị giới hạn, nên real - time qPCR có thể được sử dụng để tính toán một cách đáng tin cậy và chính xác lượng mẫu ban đầu có trong phản ứng dựa trên lũy thừa mô tả tiến trình phản ứng.
Cq của phản ứng được xác định chủ yếu bởi lượng mẫu có mặt tại thời điểm bắt đầu phản ứng khuếch đại. Nếu mẫu ban đầu nhiều, thì cần ít chu kỳ khuếch đại để tích lũy đủ sản phẩm để hiển thị tín hiệu huỳnh quang vượt qua đường nền. Do đó, phản ứng sẽ có Cq thấp, hoặc sớm. Ngược lại, nếu sử dụng một lượng nhỏ mẫu ban đầu, thì sẽ cần nhiều chu kỳ khuếch đại hơn để tín hiệu huỳnh quang vượt qua đường nền. Do đó, phản ứng sẽ có Cq cao, hoặc muộn. Mối quan hệ này tạo cơ sở cho định lượng của real – time PCR.
Phân lập RNA
Thu thập mẫu
Để phân lập RNA và định lượng sự biểu hiện gen, vật liệu mẫu phải đồng nhất. Nếu mẫu bao gồm nhiều loại tế bào khác nhau, việc xác định chính xác kiểu biểu hiện của gen mục tiêu có thể khó khăn. Nếu mẫu không đồng nhất, cần sử dụng phương pháp để tách và cô lập các loại tế bào cụ thể, ví dụ: bóc tách mô, sinh thiết bằng kim và vi phẫu bằng tia laser. Sau đó, các tế bào thu thập được có thể được sử dụng để phân tích RNA.
Chiết xuất RNA
RNA tổng số hoặc poly (A +) có thể được sử dụng cho hầu hết các ứng dụng RT-qPCR. Cần phải loại bỏ RNases trong dung dịch, vật tư tiêu hao và dụng cụ thí nghiệm. Có thể mua các dung dịch không chứa RNase có sẵn hoặc xử lý các dung dịch bằng dietyl pyrocarbonat (DEPC) và sau đó hấp tiệt trùng. RNases trên đồ dùng thí nghiệm cũng có thể bị vô hiệu hóa bằng cách xử lý DEPC hoặc bằng cách đun nóng ở 250 ° C trong 3 giờ.
Các mẫu RNA đã chuẩn bị có thể cần xử lý DNase để ngăn chặn sự khuếch đại DNA bộ gen, điều này có thể dẫn đến việc phân tích sai số do số lượng bản sao của mRNA quá cao. Tuy nhiên, khi nguyên liệu ban đầu bị hạn chế, việc xử lý DNase có thể không cần thực hiện, vì thao tác này có thể làm mất RNA. Việc khuếch đại DNA bộ gen gây nhiễu có thể được ngăn chặn bằng cách tạo ra các đoạn mồi đặc hiệu cho phiên mã, ví dụ, các đoạn mồi kéo dài hoặc khuếch đại qua các điểm nối.
Phân tích số lượng và chất lượng axit nucleic
Định lượng chính xác axit nucleic là điều cần thiết để phân tích biểu hiện gen, đặc biệt khi tổng lượng ARN được sử dụng để bình thường hóa biểu hiện gen mục tiêu. Nồng độ và độ tinh khiết của RNA thường được xác định bằng cách đo tỷ số giữa độ hấp thụ UV ở bước sóng 260 nm và 280 nm.
PCR định lượng phiên mã ngược (RT-qPCR)
Hai phương pháp có sẵn để định lượng biểu hiện gen bằng RT-qPCR: RT-qPCR hai bước và RT-qPCR một bước. Trong cả hai phương pháp, RNA được phiên mã ngược thành cDNA và sử dụng làm khuôn mẫu để khuếch đại qPCR. Một bước và hai bước đề cập đến việc khuếch đại RT và real – time PCR được thực hiện trong cùng một ống hay riêng biệt. Trong phương pháp hai bước, RNA lần đầu tiên được phiên mã thành cDNA trong một phản ứng sử dụng men sao chép ngược. Sau đó, một phần của cDNA thu được sẽ được sử dụng làm khuôn mẫu cho nhiều phản ứng qPCR. Trong phương pháp một bước, RT và qPCR được thực hiện trong cùng một ống.
Thiết bị qPCR / Real - time PCR
Hệ thống phân tích real – time PCR bao gồm một bộ tuần hoàn nhiệt được trang bị mô-đun phát hiện quang học để đo tín hiệu huỳnh quang được tạo ra trong mỗi chu kỳ khuếch đại khi fluorophore liên kết với chuỗi mục tiêu. Tất cả các hệ thống qPCR đều có chức năng khuếch tán nhiệt.
Xem thêm:
